分子生物學實驗中經常需要對樣本進行濃度和純度的測定,它相當于一種質控,以此來確保下游實驗的結果可靠。那么該如何提高DNA純度測定的準確性呢?讓我們一起來看看吧!
常用的DNA濃度/純度測定設備是紫外分光光度計,它的原理是利用物質分子對紫外可見光譜區(qū)的輻射吸收來進行分析物質成分。假設現(xiàn)在有一樣物質A,它溶解在溶液內,當光照射溶液時,溶液內的A會吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長,A對不同顏色的光(不同波長)的吸收程度是不一樣的。
雙鏈的DNA,它能對波長為260nm的光進行強烈的吸收,吸收的程度可以用一個叫吸光度的數(shù)值來測量,濃度越高的DNA,理論上吸光度也越高。
最后,通過與標準品的吸光度數(shù)值對比后,就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。
DNA濃度測定通常會使用紫外分光光度計,常見的有NanoDrop這類設備。除了DNA,它還能測定RNA和蛋白的吸光度。
要提高濃度測定的準確性,需要注意以下幾點:
1. 檢測之前,務必充分混勻DNA溶液,因為這類機器的上樣檢測體積只需要1-2uL,如果樣品沒有混勻,那么每次檢測樣品濃度也會不一樣。
2. 因為上樣體積很小,所以樣品很容易揮發(fā),如果把樣品加在檢測基座后不馬上檢測的話,會導致測出來的樣品濃度偏高。
3. 實驗環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高。檢測設備應該在放置在溫度可控、通風的環(huán)境下;裝樣品的管子如果不是要進行吸取樣品操作的話,需要時刻緊閉。
4. 每次檢測完畢,都需要對檢測基座或者比色皿進行清洗和擦拭,確保不會有樣品殘留后,再進行下一次上樣檢測。
5. 空白調零,應該使用溶解待檢測樣品的溶液來調零。例如如果用水溶解DNA,那就用水調零,用其他緩沖液溶解,則用對應的緩沖液調零。
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