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各種轉(zhuǎn)染試劑中文說明
1.細胞接種：細胞密度 2-6 x106 cells/mL.
2.質(zhì)粒的準備：在 5％最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中，每 10 6 個細胞稀釋1.0 ug pDNA。
3. PEI 的準備：在 5％最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中，每 10 6 個細胞稀釋3.0 ug PEI Prime，混勻通過快速，短暫渦旋或顛倒數(shù)次試管，將 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。
4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉(zhuǎn)板，一邊將 pDNA 和 PEI 混合物逐漸滴加到細胞中。
5.于 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉(zhuǎn)染步驟：
說明：以下步驟適用于在 6 孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細胞。開始時，每 6 孔培養(yǎng)板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來很少，但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對每種細胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進行優(yōu)化。
轉(zhuǎn)染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每 6 孔培養(yǎng)板含 2-8×105的細胞（根據(jù)細胞類型而定）。在細胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常 37℃和 5％CO2）。轉(zhuǎn)染當天細胞應 40-80％融合。轉(zhuǎn)染時，用 DNA 濃縮緩沖液（EC Buffer）稀釋 1ug DNA 至 100ul 總體積（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 濃度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 渦旋 1s 以混合溶液。
重要：請保持 DNA 與 Enhancer 比例恒定。
注意：質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量會顯著影響幾個轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對于結(jié)果的解釋。因此，只應該使用最高純度的 DNA。室溫（15-25℃）孵育 2-5 分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反復吸取 5
次或渦旋 10 秒鐘以混合。
注意：沒必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會改變它的穩(wěn)定性。
室溫下（15-25℃）孵育 5-10 分鐘以形成轉(zhuǎn)染復合物。孵育過程中，從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液，用 4ml PBS 洗滌一次細胞。加入1.6ml 新鮮培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）到細胞中。加入 0.6ml 培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復合物的 EP 管中。吸取兩次以混合，立即將轉(zhuǎn)染復合物 drop-wise 加入 6 孔培養(yǎng)板的細胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復合物分布均勻。將細胞與轉(zhuǎn)染復合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當?shù)臅r間直至轉(zhuǎn)染基因表達。孵育時間和由所采用的實驗和所使用的基因決定。
Optional: 大多數(shù)情況下，不需去除轉(zhuǎn)染復合物。然而，如果觀察到細胞毒性，則需在轉(zhuǎn)染后 6-18 小時移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗滌一次細胞， 然后加入 5ml 新鮮細胞培養(yǎng)液。
瞬時轉(zhuǎn)染時，進一步試驗分析轉(zhuǎn)染基因的表達。
轉(zhuǎn)染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育 24-48 小時以使轉(zhuǎn)染基因的表達。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時，在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時，將細胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。
注意：我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個致死曲線（劑量-反應曲線）。但是一定要記住致死曲線受細胞密度的影響。
以下步驟有時是必須的：將轉(zhuǎn)染的細胞置于它們正常的培養(yǎng)液（如：不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液），然后孵育 1-2 天，然后再加入選擇性培養(yǎng)液。
